Азотфиксация

Симбиотические азотфиксирующие бактерии внутри клеток клубеньков на корнях бобовых

Азотфикса́ция — биохимический процесс, в ходе которого молекулярный азот (N₂) атмосферы восстанавливается до аммиака (NH₃) с участием специфических ферментативных систем, главным образом нитрогеназы. Этот процесс осуществляется диазотрофными микроорганизмами, включающими бактерии и археи из различных физиологических и таксономических групп. В отличие от прокариот, эукариоты не обладают способностью к азотфиксации in situ (на месте), однако они развили разнообразные стратегии для симбиоза с азотфиксирующими бактериями, что позволяет им эффективно использовать доступный азот.

Азотфиксация является фундаментальным компонентом глобального круговорота азота, сопоставимым по значимости с фотосинтезом. Этот процесс происходит в различных природных средах, включая почвы, илы, пресные и морские водоёмы, а также на корнях растений и в кишечнике многих животных. Однако наиболее активно азотфиксация протекает в почвах, где диазотрофы, такие как клубеньковые бактерии, образуют симбиозы с бобовыми растениями, что обеспечивает высокую продуктивность данного процесса — до 350 кг азота на гектар в год.

В агроценозах азотфиксация играет ключевую роль в поддержании плодородия почв, обеспечивая до 2/3 общего количества азота, усваиваемого растениями. Средняя продуктивность азотфиксации в почвах варьируется от 30–50 кг азота на гектар в год в умеренных климатических зонах до 100–150 кг на гектар в тропических регионах.

Исследование молекулярных механизмов и оптимизации условий азотфиксации является одной из приоритетных задач современной биологии и агробиотехнологии. Основные направления исследований включают активацию природных популяций диазотрофов в различных почвенно-климатических условиях, селекцию культур бактерий с высокой нитрогеназной активностью, а также разработку методов создания искусственных симбиозов между азотфиксирующими бактериями и небобовыми растениями. Эти усилия направлены на повышение эффективности использования доступного азота в сельском хозяйстве и улучшение экологического состояния агроландшафтов.

Исторические аспекты биологической фиксации молекулярного азота

История изучения биологической фиксации азота тесно переплетается с развитием земледелия, начиная с наблюдений древних земледельцев за растениями, способствующими улучшению плодородия почвы. Римские философы, такие как Катон Старший, Варрон, Плиний Старший и Вергилий, отмечали, что культуры бобовых, включая люцерну и клевер, оказывают положительное влияние на качество почвы. Эти наблюдения, основанные на эмпирическом опыте, послужили фундаментом для последующих научных исследований в данной области.

Первое научное объяснение феномена биологической фиксации азота было предложено французским агрохимиком Жаном Буссенго в 1838 году. В ходе экспериментов он установил, что бобовые растения обогащают почву азотом, в то время как зерновые и корнеплоды его истощают. Буссенго предположил, что бобовые способны фиксировать атмосферный азот, однако ошибочно считал, что этот процесс осуществляется листьями растений. Для подтверждения своей гипотезы Буссенго провёл серию экспериментов, используя стерилизованный песок и герметичные сосуды для выращивания промытых семян бобовых, таких как люпин и фасоль. В условиях, исключающих возможность инфицирования корней микроорганизмами, растения не образовывали клубеньки и не накапливали азот. Этот результат, интерпретированный Буссенго как опровержение его первоначальной идеи, привёл к отказу от дальнейших исследований в этом направлении. Лишь спустя десятилетия стало очевидным, что причиной неудачи была стерильность условий, которая препятствовала колонизации корней азотфиксирующими микроорганизмами.

Значительный вклад в понимание природы азотфиксации внёс русский ботаник и почвовед Михаил Семёнович Воронин в 1866 году. В результате детального изучения корней бобовых растений он обнаружил в клубеньках мельчайшие «тельца», которые, по его предположению, являлись результатом жизнедеятельности бактерий. Михаил Воронин предположил, что формирование клубеньков представляет собой ответную реакцию растения на проникновение микроорганизмов в корневую ткань, что стало одним из первых научных указаний на микробную природу этого процесса.

Окончательное подтверждение гипотезы о симбиотической природе азотфиксации было получено немецким учёным Германом Гельригелем в 1886 году. В ходе сравнительных исследований питания злаков и бобовых Гельригель продемонстрировал, что бобовые способны использовать атмосферный азот благодаря симбиозу с особыми бактериями, обитающими в клубеньках на корнях растений. Растения, в свою очередь, обеспечивают бактерии углеводами и минеральными веществами, что делает этот симбиоз взаимовыгодным. На основе этих исследований было введено новое родовое название Rhizobium (от греч. rhiza — корень, bios — жизнь), которое обозначает микроорганизмы, участвующие в азотфиксации. Этот термин прочно вошёл в научную литературу и используется до сих пор для обозначения бактерий, способных колонизировать корни бобовых растений.

В 1888 году голландский микробиолог Мартинус Бейеринк впервые выделил Rhizobium в чистой культуре, что позволило доказать его способность инфицировать корни бобовых растений с высокой специфичностью (например, Rhizobium trifolii для клевера, Rhizobium lupini для люпина) и индуцировать образование клубеньков, в которых происходит процесс азотфиксации. Параллельно с исследованиями симбиотических азотфиксаторов развивались работы по изучению свободноживущих микроорганизмов, способных фиксировать атмосферный азот. В 1893 году выдающийся русский микробиолог Сергей Николаевич Виноградский выделил и описал анаэробную бактерию Clostridium pasteurianum, которая способна осуществлять азотфиксацию в бескислородной среде. Это открытие существенно расширило представления о биологическом разнообразии микроорганизмов, участвующих в фиксации азота. В 1901 году Мартинус Бейеринк выделил аэробный свободноживущий микроорганизм, получивший название азотобактер (Azotobacter). Этот микроорганизм стал важной модельной системой для изучения азотфиксации и нашёл широкое применение в агротехнологиях.

С развитием методов исследования, включая внедрение изотопного метода с использованием изотопа ¹⁵N₂ и теста на восстановление ацетилена в этилен (1949 год), существенно расширился арсенал инструментов для изучения азотфиксации. Эти методы позволили выявить множество новых видов микроорганизмов, способных фиксировать азот, включая клебсиеллы, бациллы, цианобактерии и другие. Особое внимание заслуживают цианобактерии (сине-зелёные водоросли), которые играют ключевую роль в круговороте азота в водных экосистемах, особенно на рисовых полях, где их культивирование стало важным элементом агротехнологий.

В 1970—1980-х годах бразильская исследовательница Йоанна Доберейнер активно изучала ассоциативные азотфиксаторы, обитающие на поверхности корней злаков. Её работы привели к открытию и дальнейшему изучению бактерий рода Azospirillum, которые, несмотря на отсутствие способности к образованию клубеньков, колонизируют корни растений, фиксируют атмосферный азот и стимулируют рост растений за счёт выработки фитогормонов.

Роль азотфиксации в биосфере

Биологическая азотфиксация играет фундаментальную роль в круговороте азота на Земле, выступая ключевым звеном, которое связывает огромный, но инертный запас атмосферного азота с живыми организмами. Атмосфера планеты на 78% состоит из молекулярного азота (N₂), однако ни растения, ни животные не способны усваивать его непосредственно. Этот газ становится доступным для биоты только после преобразования в соединения аммония (NH₄⁺) или нитраты (NO₃⁻). Именно биологическая азотфиксация, осуществляемая специфическими микроорганизмами (бактериями, актиномицетами) и цианобактериями (сине-зелеными водорослями), является главным природным механизмом перевода атмосферного азота в усвояемые формы. Эти организмы, называемые азотфиксаторами, выступают в роли уникального «биологического моста», делая элемент из воздуха доступным для всего живого. Без этого процесса жизнь в её современном виде была бы невозможна, так как азот входит в состав жизненно важных молекул: белков, нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и многих других.

Хотя свой вклад в связывание азота вносят и небиологические процессы (грозы, извержения вулканов, промышленное производство удобрений по методу Габера-Боша), масштабы биологической фиксации являются колоссальными и превосходят все другие источники вместе взятые. Это делает её основным двигателем азотного цикла планеты. Значение этого процесса привлекает внимание учёных различных специальностей – от биологов и биохимиков, изучающих молекулярные механизмы фиксации и генетику азотфиксирующих организмов, до агрономов, разрабатывающих технологии для повышения продуктивности растениеводства. Перспективы исследований лежат в области поиска новых азотфиксирующих сообществ, изучения их взаимодействия с растениями и, в конечном счёте, снижения зависимости сельского хозяйства от энергоёмких химических удобрений за счёт использования природного потенциала биологической азотфиксации.

Приблизительная оценка объёмов азотфиксации в мировом масштабе:

Источник	Примерный диапазон, млн т N / год
Биологическая фиксация азота атмосферы	≈ 200
Суша	44–200
Мировой океан	1–120
Сжигание топлива	15–40
Пожары	10–200
Грозы	8–30
Промышленное производство аммиака	100 (удобрения – 84; прочие –16)

Описание процесса биологической азотфиксации

Азотфиксация биологическая представляет собой процесс связывания атмосферного азота и его преобразования в азотсодержащие соединения с помощью микроорганизмов, включая свободноживущие формы и симбиотические ассоциации с растениями, а также цианобактерии.

N₂ ​+ 8H⁺+ 8e + 16ATФ → 2NH₃​ + H₂​ + 16AДФ + 16Ф

Ключевым промежуточным продуктом данного процесса является аммиак, синтез которого катализируется мультиферментным комплексом нитрогеназы. Этот ферментный комплекс состоит из двух компонентов: Mo-Fe-белка (собственно нитрогеназы) и Fe-белка (редуктазы нитрогеназы), и лишь их совместное функционирование обеспечивает высокую активность системы.

Mo-Fe-белок, обладающий молекулярной массой в диапазоне 200–250 кДа, состоит из четырёх субъединиц двух типов. В его состав входят два атома молибдена, представленных в виде FeMo-кофактора, 28–34 атома негеминового железа и 18–24 атома сульфидной серы. Fe-белок, молекулярная масса которого составляет 50–60 кДа, образован двумя идентичными субъединицами. Нитрогеназы различного происхождения демонстрируют значительное структурное и функциональное сходство, что подтверждается возможностью создания активных гибридных систем, например, путём комбинации Mo-Fe-белка из азотобактера с Fe-белком из клубеньков бобовых растений.

Помимо азота, нитрогеназа способна восстанавливать ряд соединений с тройной связью, таких как азиды, цианиды и ацетилен. Эта особенность используется для оценки азотфиксирующей активности микроорганизмов. Для эффективного функционирования нитрогеназы необходим непрерывный приток энергии в форме АТФ и электронов. Этот процесс обеспечивается за счёт аэробного дыхания, брожения или фотосинтеза. АТФ специфически взаимодействует с Fe-белком, образуя комплекс, который переносит электроны от ферредоксина к Mo-Fe-белку. Восстановленный Mo-Fe-белок способен связывать молекулярный азот (N₂) и восстанавливать его до аммиака (NH₃).

Исследования в области азотфиксации включают установление структуры и локализации генов, кодирующих нитрогеназу. Успешно осуществлён перенос этих генов из азотфиксирующих бактерий в кишечную палочку, что привело к приобретению последней способности к азотфиксации. Перспективные направления исследований включают поиск высокоактивных штаммов азотфиксирующих микроорганизмов и изучение возможности переноса генов азотфиксации в высшие растения. Это позволило бы существенно снизить зависимость от применения азотных удобрений.

Роль клубеньковых бактерий в азотфиксации

Ключевую роль в процессе симбиотической азотфиксации играют специализированные микроорганизмы — клубеньковые бактерии рода Rhizobium. Эти бактерии вступают в симбиоз с бобовыми культурами, в результате чего на корнях растений образуются клубеньки, выполняющие функцию специализированных «фабрик» по усвоению азота. Процесс является взаимовыгодным: бактерии получают от растения органические соединения, производимые в процессе фотосинтеза, а растение, в свою очередь, обеспечивается легкодоступной формой азота — аммонием (NH₄⁺), в который бактерии преобразуют инертный атмосферный газ (N₂).

Эффективность работы клубеньковых бактерий зависит от нескольких критически важных условий:

1. Наличие активных штаммов: в почве должны присутствовать вирулентные и конкурентоспособные штаммы Rhizobium, способные установить связь с растением-хозяином.
2. Высокая концентрация бактерий в зоне корня: достаточная плотность бактериального населения вокруг корней необходима для успешного заражения и образования клубеньков.
3. Дефицит азота в почве: процесс симбиоза активируется преимущественно в условиях недостатка доступного азота, так как при его избытке растение становится устойчивым к бактериальной инфекции.

Важным показателем активности бактерий является цвет клубеньков. Красный или красно-коричневый оттенок свидетельствует о наличии леггемоглобина и активной фиксации азота, в то время как серый или зеленоватый цвет указывает на неработающий, нежизнеспособный клубенёк.

Сравнение эффективности разных групп азотфиксирующих бактерий:

Группа бактерий	Количество фиксированного азота (кг/га в год)	Особенности
Rhizobium	100—300	Образуют клубеньки на корнях бобовых
Azotobacter	20—40	Свободноживущие, обогащают почву
Clostridium	10—30	Работают в анаэробных условиях
Nostoc	15—25	Могут жить в симбиозе с другими растениями

Глобальные вызовы связанные с изучением азотфиксации

Необходимостью более детального понимания экосистем и их компонентов, а также прогнозирования последствий антропогенных воздействий на биогеохимические циклы. В условиях интенсивного использования природных ресурсов, таких как почвы, водоёмы и океаны, наблюдается расширение спектра исследований азотфиксирующих микроорганизмов, включая диазотрофов. Диазотрофы представляют собой прокариоты, способные катализировать процесс восстановления молекулярного азота до аммония, что является критически важным для биогенного круговорота азота.

В последние десятилетия значительно возросло количество описанных факультативных и ассоциативных симбиотических систем, функционирующих в различных средах обитания, включая морские экосистемы, тундровые ландшафты, ризосферу сельскохозяйственных культур и другие. Однако механизмы этих ассоциаций, количественные характеристики азотфиксации и вклад диазотрофов в азотный цикл до сих пор остаются недостаточно изученными.

Растущие потребностями в увеличении сельскохозяйственной продуктивности, что особенно актуально в контексте глобального демографического роста. Это стимулировало интенсивные исследования в области азотфиксации. Согласно современным оценкам, общий объём связанного азота на Земле составляет около 2,4 × 10⁴ тонн, из которых 65 % обусловлено деятельностью почвенных диазотрофов, 25 % — промышленным синтезом аммиака по методу Габера-Боша, а оставшиеся 10 % — естественными процессами окисления азота в атмосфере.

Промышленные методы фиксации азота характеризуются высокими температурными режимами (400-500 °C) и давлениями (200-1000 атм), в то время как биологические процессы протекают при гораздо более мягких условиях. Открытие фермента нитрогеназы в 1960 году, катализирующего восстановление азота до аммиака, стало важным этапом в исследовании азотфиксации, стимулировав разработку как биологических, так и химических методов фиксации азота.

Научные исследования в этой области можно условно разделить на два основных направления. Первое направление направлено на оптимизацию ферментативных реакций для создания более эффективных методов химической фиксации азота, способных удовлетворить потребности сельского хозяйства в азотных удобрениях. Второе направление связано с развитием генетической инженерии микроорганизмов, что открывает перспективы переноса генов азотфиксации от природных диазотрофов к другим микроорганизмам или даже высшим растениям.

Актуальные направления исследований в области азотфиксации включают:

• Идентификацию и изучение новых микробно-растительных ассоциаций, их роли в глобальных азотных циклах.
• Исследование молекулярных механизмов взаимодействия растений и азотфиксирующих микроорганизмов.
• Изучение физико-химических основ процесса азотфиксации на молекулярном уровне.
• Генетическую инженерию растений с целью создания азотфиксирующих культур.
• Разработку агробиотехнологических методов для повышения эффективности азотфиксации в сельском хозяйстве.